BOLLETTINO PER LE FARMACODIPENDENZE E L'ALCOOLISMO

ANNO XX 1997 no 2

II. Nova e vetera nel settore diagnostico dell'AIDS

Parole chiave: PCR, Genetica HIV, CD4+, Anticorpi Anti-gp120, TNF-alfa, IL-6


La complessità genetica dell'HIV-1 comporta difficoltà diagnostiche soprattutto nei confronti dei ceppi del gruppo 0 (1), per cui, ad esempio, si teme che possano esservi false negatività nello screening delle unità di sangue. Si sperava molto sui nuovi test basati sui peptidi sintetici o sugli antigeni “recombinant” ma a quanto sembra, e come si avrà modo di indicare per la PCR, i test classici sembrano più sicuri. Appare importante collegare l'applicazione di indagini basate sull'impiego di peptidi sintetici per isolare nuovi sotto-tipi. In Africa queste ricerche sono rese complesse dalla notevole variabilità generica dei sotto-tipi diffusi e gli errori maggiori si fanno nella WB. E' necessario comunque un sistema globale di monitoraggio basato soprattutto sullo screening di gruppi di popolazione ad alto rischio di infezioni retrovirali (prostitute, tossicodipendenti). Certo si tratta di indagini costose ma è appena il caso di rilevare come siano utilizzabili gli stessi gruppi per trials terapeutici: in particolare allorquando soggetti a rischio elevato risultano sieronegativi con i test classici e non mancano indicazioni cliniche diventa opportuno l'impiego di sonde specifiche per altri sotto-tipi rispetto a quelli prevalenti nell'area o possono utilizzarsi test di mobilità eteroduplice; grosso modo diventa necessaria una rete di scambio di sieri e di informazioni analoga a quella tipica del monitoraggio dei virus influenzali.

L'interpretazione del significato della diversità di espressione antigenica degli anticorpi è oggetto di analisi e di ipotesi da parte di un gruppo di immunologi di Boston (2). Attraverso la focalizzazione isoelettrica della risposta umorale e gli studi sierologici e molecolari delle immunoglobuline IgG derivanti da diversi comparti linfoidi di HIV+ si evidenzia la connessione fra l'impiego di geni della famiglia VH3 e le fasi della anormalità della serie B. Importante appare l'impiego di anticorpi monoclonali derivanti da pazienti: sarebbe opportuno utilizzare famiglie di geni della regione variabile a catene pesanti (VH).

Le attese che aveva destato l'introduzione della PCR vanno ridimensionate, per cui, secondo una recente metanalisi (3), le tecniche di amplificazione genetica per il momento andrebbero limitate a quelle condizioni cliniche nelle quali i test di base sono insufficienti. Infatti la PCR da sola, a parte il maggior tempo impiegato ed i costi, non è in grado di dare sicurezza senza un test di conferma. La sensibilità infatti varia dal 10 al 100% e la specificità dal 40 al 100%. Attraverso un assemblaggio dei diversi calcoli si indica come punto limite la specificità superiore al 98,1% con una sensibilità inferiore alla stessa percentuale. Se si preferisce una identità percentuale fra sensibilità e specificità la percentuale dei falsi positivi può variare dall'1,9% al 3,0%. Naturalmente bisogna sempre tenere conto quando si parla di sensibilità e specificità della prevalenza dell'infezione da HIV nell'area. Infatti il valore predittivo di una PCR varia dal 34% allo 85% nel passaggio da endemie HIV dell'1% a quelle del 10% sulla popolazione adulta. Sono sempre più necessari standard per le sonde; inoltre negli studi è opportuno includere sia malati (nei quali è importante giungere a sensibilità elevate) sia soggetti apparentemente sani (per i quali è essenziale una alta specificità). Assumono, al riguardo, particolare rilievo le curve ROC determinate dalla trasformazione retroattiva delle curve di regressione lineare.

Da fonte danese (4) seguendo nel tempo (65 mesi come mediana) 25 sieroconvertitori viene una conferma del valore prognostico di un carico virale iniziale elevato, mentre non sembra che il rapporto fra ceppi inducenti il sincizio e ceppi non inducenti (SI e NSI) si colleghi a valori di RNA virale. Comunque si conferma l'andamento quantitativo dell'RNA virale: elevato nella fase iniziale, quindi decrescente fino a raggiungere un plateau, per poi innalzarsi nella fase terminale. Si evidenzia anche una correlazione fra ritmo di diminuzione dei CD4+ e livelli quantitativi di RNA virale; invece non si è notata associazione fra ceppi inducenti la formazione di sincizi e quantità di RNA virale (come si è già indicato). Il che non toglie valore alla presenza di ceppi SI che comunque sono di valore prognostico.

L'Infezione da HIV si accompagna a modifiche dei lipidi della membrana cellulare di linfociti periferici, monociti e cellule linfoblastoidi; di già ricerche condotte presso l'Università romana La Sapienza avevano individuato aumenti di espressione di acido salico contenente glicosfingolipidi. Ora attraverso la collaborazione con Istituti universitari di Tokyo (5) sulla base di indagini condotte su 25 HIV+ asintomatici, 25 casi di AIDS e 25 donatori di sangue sani nonché su altrettanti pazienti affetti da altre malattie virali, si è dimostrato:

  1. l'aumento del contenuto di un monosialoganglioside GM3 sulle membrane dei corpuscoli plasmatici;
  2. la presenza di livelli elevati di anticorpi GM3 nel circolo di pazienti affetti da AIDS con andamento progressivo della malattia;
  3. nei soggetti asintomatici la presenza di anticorpi anti-GM3 assume un significato prognostico per la comparsa di AIDS (anche in assenza di sintomi).

Ma che significato può avere questa eccessiva espressione? Gli anticorpi anti-GM3 rappresentano una componente anticorpale che reagisce con i linfociti CD4+ e, quindi, contribuiscono alla deplezione della serie T. C'è anche di mezzo comunque un rapporto con il Fattore Tumorale di Necrosi alfa che come è noto è un induttore del meccanismo di apoptosi (TNF-alfa).

Nei cervelli di 13 pazienti morti di AIDS, rispetto ai cervelli di pazienti deceduti per altre malattie o traumi, una ricerca collaborativa fra Istituzioni universitarie Californiane e l'Istituto Weizman di Israele (6) ha confermato l'aumento del TNF-alfa nel tessuto cerebrale dei malati di AIDS. La ricerca si è approfondita nella individuazione dei recettori TNF Rs p55 e p75: si è visto che questi recettori hanno una iper-regolazione nel cervello dei casi di AIDS e che le cellule che questi recettori esprimono sono soprattutto macrofagi e cellule della microglia. Tutto fa ipotizzare che il ruolo del TNF-alfa nella patogenesi della dementia praecox sia esaltata dalla iperproduzione di queste citochine e che quindi precocemente si realizzino i presupposti per la neurodegenerazione ed i processi encefalitici dell'AIDS. Trattasi di ricerche che solo in parte possono dare luogo a test utili per evidenziare precocemente il coinvolgimento neurologico.

Altrettanto dicasi per una ricerca francese multicentrica (7) che ha saggiato il ruolo dell'interleukina 6 (IL-6) in vivo somministrando anticorpi monoclonali IL-6 su 11 pazienti affetti da AIDS contro pazienti affetti da linfomi. L'iperproduzione di IL-6 negli stadi avanzati dell'AIDS non sembra provocare in vivo la replicazione dell'HIV ma induce profonde modifiche immunologiche che possono avere importanza nelle fasi avanzate della malattia. Dal punto di vista sierologico appare interessante la correlazione fra la riduzione dell'iperattività B-linfocitaria ed i livelli di IL-6. Sempre considerando il collegamento fra “vivo” e “vitro” è l'insieme delle tecniche attuate presso l'Università di Berkeley (8) che può essere menzionato come metodo. Infatti stimolando in vitro, mediante antigeni ed attivatori policlonali, le cellule T provenienti da HIV+ ed HIV- si è dimostrata una riduzione di espressione di CD69 nei linfociti provenienti da HIV+. Si delinea in tal modo un test in grado di individuare rapidamente le alterazioni immunologiche e di monitorare l'azione degli agenti immunomodulatori.

Ancora sul valore delle conte dei CD4+ per la prognosi: si tratta dell'insieme dei dati ricavati da una serie di 5.204 HIV+ suddivisi in diversi “strati” a seconda del numero di CD4+ e arruolati fra il 1990 ed il 1993 con un follow-up mediano di 23 mesi (9). In questo periodo 1.703 pazienti sono morti. Per quelli al di sotto di 25 CD4 la mortalità cumulativa dopo 24 mesi è stata del 72% ed è progressivamente migliorata fino a raggiungere il 10% quando i CD4+ erano fra i 200 ed i 499. Il tempo mediano di sopravvivenza è stato di 15 mesi per coloro che avevano meno di 25 CD4+, 21 mesi quando ci si trovava fra 25 e 49 CD4+, 40 mesi per coloro che avevano da 100 a 199 CD4+. In ciascun “strato” di CD4+ i quozienti di mortalità sono stati più elevati per coloro che presentavano ab initio una storia clinica di progressione: praticamente 1,6 volte la mortalità media dello strato. L'indagine è stata condotta mediante prelievi annuali. Via via che le conte si abbassano le determinazioni vanno effettuate a tempi più ravvicinati, ma non sembra che la conta dei CD4+ possa rappresentare di per se stessa un marker surrogatorio della progressione della malattia. Vanno considerati altri parametri clinici e sierologici (l'ipergammaglobulinemia, ad esempio, che di per se stessa rappresenta un segnale di ipersensibilità verso i farmaci).

Si conferma il ruolo, e quindi il valore diagnostico, degli anticorpi contro gli antigeni dell'envelope (gp120). Dall'Harvard School of Public Health (10) utilizzando la tecnica di radioprecipitazione (RIP) sia nel liquor che nel siero di 21 soggetti con AIDS Dementia Complex (ADC) e 10 HIV+ asintomatici, solo in 1 caso fra questi ultimi si sono riscontrati questi anticorpi nel liquor. Invece, nei soggetti con sintomatologia neuropsichiatrica si sono avuti reperti, specie liquorali, positivi in relazione con la gravità dei sintomi. Il dato è interessante in quanto viene ad avvalorare le ricerche che hanno dimostrato in vitro il ruolo degli antigeni gp120 nella patogenesi della dementia da AIDS. Si tratta ora di valutare prospetticamente il significato prognostico di questo marker.

Senza dubbio nella diagnosi delle alterazioni a carico del Sistema Nervoso Centrale assumono crescente importanza le neuroimmagini (11): risonanza magnetica, spettroscopia protonica, tomografia ad emissione di singolo fotone, con quadri ormai consolidati per le varie patologie fra le quali anche quelle da CMV. Per l'insieme delle affezioni legate al CMV ricercatori tedeschi (12) partono dalla considerazione che in soggetti immunocompromessi come i casi di AIDS avanzato nei quali è più frequente l'attacco del CMV, la determinazione degli anticorpi assume scarso valore diagnostico. Certo le localizzazioni gastrointestinali possono avvalersi della PCR su prelievo intestinale; nel caso della retinite invece sembra che solo la clinica possa essere utile. La ricerca dell'antigene CMV-pp65 nei polimorfonucleati mediante anticorpi monoclonali ed utilizzando colorazioni speciali (alcalino-fosfatasi anti-alcalino-fosfatasi) si è individuata, in una ricerca prospettica su 144 pazienti HIV+ con quadri clinici sospetti, una sensitività del 90% ed una specificità del 93%. Il test è di rapida effettuazione; se ne raccomanda l'attuazione nei pazienti con manifestazioni febbrili non corrispondenti a quadri clinici precisi.

Meglio ancora se come hanno fatto a New Haven (13) si adotta un metodo quantitativo utile quando il quadro oftalmologico non è chiaro: naturalmente trattasi sempre di determinazioni nei leucociti ed il valore soglia è più di 48 cellule positive/2 x 105 PBL.

Si è detto che la sierologia CMV non assume grande importanza, tuttavia, come osserva Shepp (14) sulla base di osservazioni sierologiche prospettiche condotte su 196 HIV+ in stadi avanzati con diversa composizione socio-demografica, si è verificata malattia da CMV nel 25,6% dei sieropositivi ed in nessun caso di sieronegatività. Fra i sieropositivi la comparsa di malattia da CMV è stata rapportata al corrispondente gruppo a rischio per l'infezione da HIV: praticamente si è manifestata nel 35% degli omosessuali, nel 33% degli eterosessuali ma solo nel 4,3% dei tossicodipendenti. Il che significa che il fattore di rischio più importante per l'acquisizione dell'infezione da CMV è quello sessuale. Lo stato sierologico nei confronti del CMV non ha influenza nei riguardi della comparsa di altre malattie opportunistiche.

Con l'aumento dei casi di infezione da HIV si estende la richiesta di determinazione quantitativa dei CD4+: il Servizio di Sanità Pubblica USA suggerisce il monitoraggio ogni 3-6 mesi. In genere la tecnica consiste nella marcatura dei linfociti con anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo: ciò permette il calcolo della proporzione di linfociti marcati attraverso la citofluorometria a flusso. Per valutare i CD3+ ed i CD4+ l'analisi ematologica seguita dalla citometria a flusso laminare è costosa e richiede sangue fresco prelevato da meno di 18 ore. Pertanto un gruppo di ematologi californiani (15) ha valutato metodi alternativi, vale a dire il sistema FACS, quello VCS, il KIT Zymmune CD4/CDB ed il Test TRA. Si è confrontato il risultato dell'esame classico con la citometria a flusso e con questi metodi alternativi su sangue di HIV+ e di donatori HIV- prelevato da meno di 6 ore fino a 24-36 ore dopo la flebotomia. I coefficienti di correlazione rispetto al metodo classico variano da 0,84 a 0,92 indipendentemente dalla distanza oraria dal prelievo. I vantaggi sono pertanto notevoli sia per quanto si riferisce ai costi sia al grado di expertise necessario per l'analisi.

Il gruppo clinico collaborativo britannico sull'AIDS si è domandato: quando praticare il test sierologico completo (cioè con WB) dopo una possibile esposizione (16)? La domanda è stata rivolta a tutti i consulenti dei Servizi genito-urinari inglesi (ricordiamo che nel Regno Unito questi Servizi rappresentano il punto più importante di diagnosi delle infezioni da HIV). Le risposte per quanto riguarda l'intervallo fra la possibile fonte e la effettuazione del test sierologico varia da 3 mesi a 5 anni. In effetti si riscontrano due tendenze:

  1. quando il contatto è rappresentato da soggetto non noto come HIV+ l'intervallo raccomandato è di tre mesi;
  2. quando, invece, il contatto è un soggetto noto come sieropositivo l'intervallo è in genere di sei mesi.

Solo una minoranza di questi Servizi ambulatoriali segue le linee guida prescritte relative agli intervalli il che fotografa una situazione molto disomogenea.

In Olanda (17) la notificazione delle sieropositività in anonimato riduce la frequenza dei doppioni mediante una codificazione che da la possibilità di raccogliere dati anamnestici e clinici da parte dei medici allorquando il test è positivo. Le fonti di segnalazione sono costituite dai medici di base (con una prevalenza di sieropositività dell'1,4%) e dalle Assicurazioni (con un solo caso di HIV+).

La diagnosi di neurosifilide nei soggetti HIV+ può presentare difficoltà secondo un gruppo di patologi di Seattle (18); l'impiego della PCR nel liquido cefalo-rachidiano non ha rappresentato alcun vantaggio rispetto al sistema classico della VDRL. Purtuttavia tenendo conto di altri studi nulla vieta che vi si faccia ricorso trattandosi di tecnica ormai semplice.

Rimane, infine, problematica l'utilità della determinazione nei leucociti periferici del DNA del virus JC, un poliomavirus ubiquitario che colpisce nelle fasi infantili almeno il 70% della popolazione senza provocare sintomi. Virologi di Bordeaux (19) partendo dalla connessione fra presenza dell'JCV in soggetti immunocompromessi e lo sviluppo della Leucoence-falopatia Multifocale Progressiva (PML), una malattia dovuta all'infezione litica degli oligodendrociti con l'ipotesi di una riattivazione endogena, hanno effettuato la ricerca PCR del DNA su 135 HIV+. In effetti nel 28,9% degli HIV+ si identifica questo DNA: trattasi di valutare il significato prognostico di tale reperto.

Bibliografia

  1. Hu D.: JAMA, 275: 210, 1996
  2. Wisnewski A.: J. AIDS Human Retrovir., 11: 31, 1996
  3. Ownes D.: Annals Internal Medicine, 124: 803, 1996
  4. Katzenstein T.L.: AIDS 10: 167, 1996
  5. Sorice M.: J. AIDS Human Retrovr., 12: 112, 1996
  6. Sippy B.D.: J. AIDS Human Retrovir., 10: 511, 1995
  7. Marfaing-Koka A.: J. AIDS Human Retrovir., 11: 59, 1996
  8. Krowska J.F.: J. AIDS Human Retrovir., 11: 95, 1996
  9. Saravolatz L.: Clinical Infectious Diseases, 22: 513, 1996
  10. Trujillo R.J.: J. AIDS Human Retrovir., 12: 19, 1996
  11. Walot I.: Clinical Infectious Diseases, 22: 906, 1996
  12. Salzberger B.: J. AIDS Human Retrovir., 11: 365, 1996
  13. Wetherill P.E.: J. AIDS Human Retrovir., 12: 33, 1996
  14. Shepp D.H.: J. AIDS Human Retrovir., 11: 460, 1996
  15. Johnson D.: J. AIDS Human Retrovir., 10: 522, 1995
  16. British Cooperative Clinical Group: Int. J. STD & AIDS, 6: 322, 1995
  17. Van Duynhoven Y.T.H.D.: Int. J. STD & AIDS, 7: 117, 1996
  18. Marra C.: J. Infectious Diseases, 174: 219, 1996
  19. Dubois V.: AIDS, 10: 353, 1996