BOLLETTINO PER LE FARMACODIPENDENZE E L'ALCOOLISMO

ANNO XX 1997 no 2

III. Sempre in evoluzione la patogenesi dell'AIDS

Parole chiave: Citochine, Chemochine, Fusina, Linfociti CD8, Secondo Recettore, Sarcoma Kaposi


Alcune importanti conferme circa ipotesi patogenetiche formulate all'epoca dell'XIesima Conferenza Internazionale di Vancouver (7-12 Luglio 1996) hanno trovato conferma nel novembre '96 e quindi non sono state incluse nelle aggiornate sintesi compilate a conclusione della Conferenza.

Per troppo tempo come osserva Griffiths, virologo del Royal Free Hospital di Londra, ci si è fissati sul concetto di infezione da HIV come qualcosa di nuovo nella storia della virologia (1) senza tenere conto del fatto che gli Herpes Virus, il CMV e, sotto alcuni aspetti, il Polio Virus (vedi sindrome post-polio) sono egualmente agenti virali che dopo una infezione primaria rimangono a lungo nell'organismo. Come dimostra il fallimento dell'Acyclovir nell'eradicazione dell'Herpes Virus e del Gancyclovir nelle polmoniti da CMV, solo l'attacco farmacologico antivirale nella fase iniziale può avere successo. Nello stesso tempo si sottolinea come troppo semplicisticamente si parla di resistenza dell'HIV nei confronti dell'AZT mentre è l'immunodefcienza che impedisce la modulazione di tutti i meccanismi antivirali. Pertanto appare essenziale individuare precocemente l'infezione ed agire terapeuticamente senza attendere la fase dell'AIDS conclamato.

Negli ultimi dodici mesi due importanti filoni di ricerca sono confluiti indipendentemente l'uno dall'altro, come osserva D'Souza (2), sul piano dello studio delle chemochine, cioè dei messaggeri chimici che attirano i globuli bianchi nelle aree dell'infiammazione e che solo da poco tempo sono state considerate diverse dalle linfochine e dalle monochine. Nel 1987 è stata identificata l'interleukina-8 (IL-8) ed è stato coniato il termine di chemochine cioè di fattori che associano alle proprietà di chemio-attrazione quelle delle citochine cioè dei messaggeri dell'omeostasi del sistema immunitario che nell'infezione da HIV hanno una iper-espressione ed anche alterazioni nella loro reciproca regolazione (IL-6, Interferon-alfa, IL-10, TNF-alfa). Le chemochine si suddividono in due gruppi:

  1. le alfa che attivano in via primaria i neutrofili;
  2. le beta che, in genere, attivano i monociti, i linfociti, i basofili e gli eosinofili.

Le beta-chemochine costituiscono i soppressori solubili dell'attività dell'HIV1 che per diverso tempo sono stati identificati con i linfociti T citotossici CD8 (quanto mai presenti negli HIV+ che non progrediscono verso la malattia e nelle prostitute della costa occidentale africana che non si infettano malgrado contatti multipli non protetti). L'attività di soppressione dell'HIV da parte dei CD8 avviene anche in assenza dei linfociti citotossici a causa di un fattore solubile che appunto blocca l'entrata del virus che solo nel dicembre 1995 è stato identificato in tre chemochine RANTES, MIP-alfa, MIP-beta. Tutto è stato reso possibile dalla identificazione di nuove linee cellulari come PM1 altamente sensibili che consentono la replicazione dell'HIV e dall'immortalizzazione del clone dei CD8 produttore di sostanza solubile soppressiva. Tale soppressione ha luogo sia nei confronti dei virus adattati alle culture sia di quelli presenti nei linfociti e nei macrofagi che sono da isolamento primario. Invece le chemochine sopprimono la replicazione dei soli virus primari nelle cellule CD4.

Il secondo mistero svelato negli ultimi dodici mesi è l'individuazione di due recettori delle chemochine necessari perché l'HIV-1 entri nelle linee T immortalizzate e nei polimorfonucleati; in precedenza si era dimostrato che i ceppi di HIV-1 potevano essere distinti in ceppi con tropismo verso i macrofagi (M-tropici) e ceppi con tropismo verso i linfociti T (T-tropici). I primi sono quelli più facilmente isolabili nella fase primaria ed in quella asintomatica, si replicano sui polimorfonucleati ma non danno luogo a fusione dei sincizi (caratteristica di maggiore virulenza come i lettori già da tempo sanno); al contrario i ceppi T sono induttori di formazione di sincizi. Le sperimentazioni sul modello murino avevano dimostrato l'incapacità dell'HIV-1 di penetrare in quanto nel modello animale non era presente un allora ipotetico secondo recettore la cui ricerca ha impegnato una diecina di anni. Fu nell'aprile 1996 l'individuazione da parte di Berger (3) di una glicoproteina del settimo settore trans-membranico che quando coespressa con i CD4 nelle cellule murine permette la fusione con le cellule portatrici di T ma non di M-HIV-1. Donde il nome di fusina successivamente modificato in CXC-chemochina-recettore-4 (CXCR-4). Hoxie (5) ha descritto il primo anticorpo monoclonale per la fusina ed ha dimostrato come alcuni ceppi di HIV-2 possano utilizzare la fusina come recettore alternativo per la penetrazione nelle cellule in assenza di CD4. I recettori appartengono al gruppo di molecole della proteina G, riconoscono i segnali e transducono questi segnali in una risposta intra-cellulare. Il ligando naturale della fusina è un cofattore derivato dalle cellule stromali l'SDF-1 un chemoattrattivo efficace per le cellule T.

Rimaneva però il problema degli M-HIV-1, problema che è stato risolto attraverso una fortuita identificazione di un recettore che rispondeva ai MIP-1alfa, MIP-1beta e RANTES che è stato denominato CCR-5. Tale recettore è stato oggetto di intense ricerche condotte su linee diverse coinvolgenti il CD4, il gp120, il CXCR-4 e l'ansa V3. In breve il gp120 dell'HIV si lega ai CD4 ed il risultato è una modificazione della conformazione che espone l'ansa V3 nella gpl20 e può interagire sia con il CXCR-4 sia con il CCR-5.

Negli individui non infetti malgrado continue esposizioni da una parte i CD8+ dimostrano una notevole attività antivirale, ma soprattutto i loro CD4+ sono meno suscettibili di infezione da parte dei ceppi-M, e questo non per carenza di molecole CD4 sulla superficie delle cellule quanto per l'attività dell'ormai famoso gruppo delle beta-chemochine RANTES, MIP-1alfa e MIP-1beta. E' probabile che una variazione genetica nei recettori CCR-5 può costituire una protezione nei confronti degli HlV-1 introdotti per via sessuale o parenterale che non infettano le linee cellulari T ed i macrofagi. Il difetto congenito è una delezione dell'omozigote 32-bp, mentre negli eterozigoti non sembra esservi questa protezione (ma quest'ultimo dato non è concorde e comunque il polimorfismo del CCR-5 ha un ruolo importante nella trasmissione dell'HIV e nel meccanismo patogenetico). Comunque la frequenza dell'allele CCR-5 è del 18% negli eterozigoti, dell'1% negli omozigoti fra popolazioni di origine europea, del 12% e 4% fra gli afro-americani.

Non tutto ancora viene spiegato ma le possibilità di produrre conigli transgenici o topi con CD4 e recettori delle chemochine umane potrà gettare luce sui punti ancora oscuri quali il meccanismo attraverso il quale i CXCR-4 recettori evadono l'infezione con i ceppi T. Il fatto che gli omozigoti per la delezione del gene CCR-5 siano a bassissima frequenza od assenti nelle popolazioni non-caucasiche dell'Africa ed Asia può spiegare la rapidità di diffusione dell'HIV-1 e forse il polimorfismo europeo può essere legato a risposte protettive nei confronti di altri patogeni; di conseguenza si formulano interessanti analogie con l'antigene Duffy che manca in molte popolazioni al disotto del Sahara e la mancanza è collegata con una certa resistenza nei confronti della malaria.

Queste importanti ricerche hanno ridotto il pessimismo imperante fino a poco tempo fa ed hanno attirato verso la ricerca nuove e fresche forze di virologi ed immunologi. La vecchia guardia non demorde e dal Laboratorio di Gallo provengono le linee cellulari e le applicazioni bio-molecolari che hanno consentito lo sviluppo delle ricerche sulle chemochine. Fauci d'altra parte così riassume le più recenti vedute sulla patogenesi (6): il livello della replicazione dell'HIV riflette un equilibrio fra fattori di stimolazine e fattori di inibizione propri dell'ospite, con particolare riguardo per le citochine endogene. Intanto fra i fattori esogeni che favoriscono la replicazione dell'HIV ricorda i patogeni opportunistici: ad esempio il Mycobacterium Tuberculosis aumenta la viremia plasmatica che torna a livelli precedenti quando viene controllata la malattia tubercolare. L'accelerazione della replicazione virale è legata all'attivazione cellulare dovuta alle infezioni croniche così frequenti nei Paesi africani ed asiatici: attivazione immunitaria dovuta alle citochine inducenti l'HIV come l'IL-6, l'IL-1beta ed il TNF-alfa. Il ruolo dell'attivazione è stato confermato nel modello scimmiesco (SIV) e nelle infezioni da HIV degli chimpanzè. Del resto negli HIV+ dopo vaccinazione antinfluenzale ed antitetanica si manifesta un aumento della viremia e dei mononucleati periferici; questi ultimi isolati nei momenti di picco viremico in vitro assicurano una maggiore replicazione virale. D'altra parte non mancano dimostrazioni di più intensa replicazione in vitro in colture di PBMC (cellule mononucleri) provenienti da individui sani sottoposti a vaccinazione antitetanica. Pertanto i fattori esogeni regolano la replicazione virale soprattutto alterando l'attivazione cellulare e la produzione di citochine.

Citochine endogene: l'HIV-1 infetta direttamente le cellule del sistema immunitario e, quindi, è una fonte di secrezione di citochine pro-infiammatorie (TNF-alfa, IL-6 ed IL-1beta) che aumentano nei PBMC mentre l'espressione di queste citochine insieme a quella dell'IFN-gamma è notevolmente aumentata nel tessuto linfoide. E' già ampiamente noto come i T-helper (Th-1) secernono IL-2 e IFN-gamma e favoriscono le risposte cellulo-mediate, mentre le cellule Th-2 secernono IL-4, IL-5 ed IL-10 e sollecitano risposte umorali; ora però si discute il concetto semplicistico che la transizione da Th-1 a Th-2 marchi la progressione della malattia in quanto vi sono molte altre cellule che secernono citochine (oltre a quelle già nominate anche i fattori stimolanti la formazione di colonie M-CSF e GM-CSF). La citochina più potente come inducente la replicazione dell'HIV è il TNF-alfa in quanto attiva il fattore di transizione cellulare NFKB che trova legami nel terminale lungo ripetitivo del genoma dell'HIV (LTR). Anche l'IL-1beta influisce nella fase transcrizionale mentre altre citochine agiscono in quella post-transcrizionale. Più sopra si è formulata l'ipotesi prevalente sul ruolo delle beta-chemochine sulla soppressione della replicazione virale e sulla differenziazione fra ceppi T e ceppi a tropismo M (questi ultimi predominanti dopo l'infezione anche quando l'individuo contagiante ha contemporaneamente ceppi M e T). La maggiore infettività delle mucose genitali già ulcerate da patologie a trasmissione sessuale mantenendo elevata la produzione di citochine può alterare l'equilibrio CCR-5/CXCR-4 a livello delle mucose favorendo l'ingresso dei ceppi M.

Comunque oggi l'attenzione torna verso le cellule di Langherans e quelle dendritiche: proprio a Varenna, Lago di Como, nello scorso ottobre (7) ha avuto luogo un incontro scientifico sui macrofagi e sulle cellule di Langherans considerate come "la seconda via di infezione e replicazione" rispetto ai linfociti T e come riserva importante specie nelle ultime fasi della malattia. I macrofagi omnipresenti sono "cellule spazzine" che non solo fagocitano ma presentano antigeni proteici estranei ai linfociti T i quali ultimi provvedono alla loro distruzione; eguale ruolo hanno le cellule dendritiche. D'altra parte come più sopra indicato, nelle fasi iniziali dell'infezione HIV i virus entrano nei macrofagi (tipi M) e, come è noto, mentre le cellule CD4-T infette muoiono rapidamente i macrofagi persistono. Ma le scoperte di Ho alla fine del 1994 circa l'enorme produzione e distribuzione dei CD4 aveva ridotto il ruolo dei macrofagi e la constatazione dell'elevata viremia anche in presenza di bassissime quantità di CD4+ ha portato nel 1996 alla rivalutazione dei macrofagi specie di quelli a livello polmonare.

A livello cerebrale è la microglia la sede preferita dall'HIV. Ma anche gli astrociti che fanno parte della barriera emato-encefalica possono essere sede del virus; è comunque probabile che il danno encefalopatico dell'HIV non sia diretto ma modulato dalla stimolazione dei macrofagi a produrre sostanze citotossiche (oltre a proprie proteine neurotossiche). Un dato estremamente importante relativo al ruolo dei macrofagi è l'individuazione di un processo di apoptosi (suicidio cellulare) che il contatto fra macrofagi infetti e cellule T provoca nelle cellule T. Ciò a seguito di una proteina Fas che scatena l'apoptosi; sempre a Varenna da parte di ricercatori italiani è stato dimostrato un ruolo dei macrofagi infetti nel provocare apoptosi degli astrociti. E' anzi probabile che i macrofagi abbiano un ruolo primario insieme alle cellule di Langherans così abbondanti a livello cutaneo. Quando sulla cute si pongono cellule infette da ceppi M e T prelevano preferibilmente le cellule M; ceppi di virus SIV manipolati in modo da non infettare i macrofagi non determinano nel macaco malattia al contrario dei ceppi selvatici. Bloccare l'infezione a livello delle cellule dendritiche e dei macrofagi, pertanto, dovrebbe essere l'obiettivo primario sia degli approcci immunologici che terapeutici, insieme alla rivalutazione del ruolo dei CD8+ (8) che ricercatori inglesi individuano come possibili punti d'ingresso del virus indipendenti dai CD4.

Comunque tornando a Fauci il quadro che propone è:


    Risposta immuno-specifica all’HIV
                   |
Fattori di soppressione derivati dai CD8+T(?)
                   |
      RANTES-MIP-1   alfa-MIP-1 b 
 (sui ceppi con tropismo per macrofagi) 
                   |
                 SDF-1 
 (sui ceppi con tropismo per le cellule T)
        Citochine inibitorie 
           (Il-10,TGF-b) 
                   |
                   |----->  REPLICAZIONE DELL’HIV -----> Attivazione cellulare 
                                                      (citochine proinfiammatorie)
                                                         TNF-alfa, IL-1b, IL-6)

Vi sono, sempre secondo Fauci, interessanti prospettive di attacco agli epitopi dei corecettori e di utilizzazione della differenziazione M e T, ma il quadro è ancora estremamente complesso.

Come commenta Cohen (9) Fauci ha avanzato un caveat "gentile": "Sarebbe meglio essere cauti nell'affermare che oggi abbiamo un bersaglio preciso da colpire" e si potrebbe aggiungere che in questa corsa allo "scoop" (ricordate l'eccitazione della stampa sul secondo recettore?) sarebbe bene avere uno scambio di risultati preliminari onde evitare conclusioni contrastanti come quelli di Landau (10) e di O'Brien (11) sul ruolo della mutazione CCR-5 per spiegare la resistenza o la progressione più lenta (comunque ricordiamo che O'Brien ha studiato 1.955 infetti e in nessuno di questi ha trovato omozigoti per la mutazione del CCR-5; inoltre ha trovato eterozigoti ma con progressione lenta).

Comunque, osserva Fauci in un altro lavoro (12), questo difetto genetico non sembra interferire con la fittness dell'ospite, il che fa sperare che bloccando i recettori CCR-5 con peptidi-anticorpi o farmaci si possa avere una interferenza con il legame dell'HIV-1-M ed il suo corecettore senza produrre effetti tossici.

Nel corso dell'ultima Conferenza Internazionale sull'AIDS si è sviluppato un dibattito fra Ho e Pantaleo che viene riassunto da Birk (13). Ho sostiene le preminenza dei fattori virali:

  1. la quantità virale dell'inoculo iniziale,
  2. la virulenza del subtipo genetico di virus,
  3. l'Incessante replicazione virale,

rappresentano il primo motore che porta alla patogenesi dell'AIDS.

Vi sono rapporti fra il carico virale ed il passaggio dei ceppi che non inducono la formazione di sincizi (NSI) a ceppi sincizio-inducenti (SI); questi ultimi hanno la capacità di utilizzare sia il recettore CCR-5 sia quello secondario della fusina.

Pantaleo attribuisce maggiore importanza a 4 fattori immunologici vale a dire:

  1. il background della classe MHC (complesso maggiore di istocompatibilità);
  2. le risposte citochiniche;
  3. le variazioni nei recettori T cellulari (TCR): una risposta TCR ampia favorisce una progressione lenta e non per nulla i pazienti che presentano il repertorio di cellule T maggiormente ristretto vanno incontro ad un decorso rapido;
  4. I livelli di produzione delle chemochine.

Ricordiamo di Pantaleo l'importanza dei rapporti che si stabiliscono nell'infezione primaria:

  1. disseminazione sistemica attaverso il tessuto linfatico;
  2. produzione elevata di antigeni virali;
  3. formazione di un grosso pool di cellule infettate in latenza;
  4. intrappolamento iniziale del virus da parte delle cellule dendritiche del tessuto linfatico;
  5. sviluppo di mutanti che "scappano" dalle trappole;
  6. delezione clonale dei CTL HIV-specifici e compartimentalizzazione dei CD8.

Solo verso il 7-12 mese dall'infezione primaria il carico virale è correlato con la progressione dell'affezione, pertanto è essenziale individuare l'insieme dei fattori immunitari nei primi sei mesi. Del resto l'esaurimento dei cloni CD8 eliminando la risposta CTL provoca la rapida disseminazione virale. Da parte di Ho si sono presentati calcoli aggiornati sulla produzione di 10 bilioni di particelle virali che vengono prodotte ogni giorno; nello stadio intermedio si producono quotidianamente 2 bilioni o più di CD4 ed un numero eguale vengono distrutte; una velocità replicativa elevata può portare all'emergenza precoce di ceppi resistenti anche in virtù di errori negli enzimi RT. Per quanto riguarda i fattori di accentuazione dell'infettività e della virulenza viene confermata l'importanza della proteina Nef associata con la chinasi cellulare PAK-65; in alcuni (ma non in tutti i malati a progressione lenta) vi sono difetti nella replica LTR della Nef e quindi minore virulentazione dell'HIV. L'attacco dell'HIV anche ai megacariociti può spiegare la trombo-citopenia abbastanza frequente nell'AIDS mentre l'ingresso nelle cellule mesangiali è alla base di disfunzioni renali.

Sempre da Birk (13) riportiamo il quadro riassuntivo dell'azione delle chemochine e citochine:

Fonti:

Macrofagi attivati -   CD4 attivati   CD8 attivati 
                             |              |
  secrezione attiva	MIP-1alfa    sia secrezione MIP
                         MIP-1beta    sia CAF (fattore associato CD8)

  Infezioni intercorrenti e vaccinazioni sistemiche
                             |
                 TNF-alfa-IL-1, IL-3, IL-6
                             |
                            HIV <---------> da parte cellulare  RANTES MIP-1beta MIP-1alfa 
                             |                                  gamma-IFN   alfa-IFN
                             |                                  Il CAF inibisce sia i virus T
                             |                                  tropici che quelli M
                             |
                             |  <---------> TGF= fattore di crescita trasformante
                                                 TGF-beta
                                                 IL-4
                                                 IL-10
                                                 IL-_	HIV


Sul Sarcoma di Kaposi (SK). Si sa che in vitro diversi fattori fra i quali l'interleuchina-6 (IL-6) sono in grado di promuovere la crescita delle cellule del sarcoma provocando lesioni simili a quelle provocate nel topo dall'inoculo dei medesimi fattori (si tratta di lesioni vascolari). Infettivologi di Tolosa (14) hanno dimostrato che almeno due di queste citochine (IL-6 e b-FBF ovvero il Fattore di Crescita di Base dei Fibroblasti) compaiono in circolo in eccesso molti mesi prima della comparsa delle manifestazioni cliniche. Forse bloccando queste citochine potrebbe essere bloccata la progressione del SK.

Come è ben noto biopsie del SK contengono sequenze dell'Herpes Virus; il KSHV ha sequenze omologhe ma distinte dai geni proteici del capside e del tegumento di altri Herpes Virus (Gamma HV, HV Saimiri), nonchè del Virus di Epstein-Barr. Fino a poco tempo fa si chiamava HHV-8. Tale virus si reperisce anche in un terzo dei casi di linfoma associato all'AIDS fra africani e nel 100% dei casi di SK classico africano (15). Inoltre in omosessuali HIV+, cioè in soggetti a rischio per il SK, si sono riscontrati anticorpi contro il peptide antigenico KSHV (16). Da ricerche in vitro praticate presso il Winship Cancer Centre dell'Università di Emory (17) si è confermato il ruolo patogenetico di fattori pro-infiammatori sollecitati da almeno due geni CAM-V e CAM-1 e dalla citochina IL-6. Si è anche visto che il ditiocarbammato di pirrolidina tiolo-ossidante (PDTC) inibisce selettivamente l'espressione dei geni nelle cellule SK che contengono KSHV facendo presupporre che nella regolazione di questi geni intervengano meccanismi di ossido-riduzione. Lo stesso PDTC potrebbe avere un ruolo terapeutico essendo anche positivo nei confronti dell'HIV. Invece la chemioterapia citotossica può esacerbare l'immunodeficienza sottostante.

Sul Virus di Epstein-Barr (EBV). Recentemente questo virus è stato correlato con una affezione tipica degli HIV+: la Leucoplachia a Cellule Capellute (OHL); normalmente gran parte dei portatori dell'EBV non sviluppano le lesioni orali tipiche dei soggetti immunodepressi; da un gruppo inglese (18) si conferma la replicazione dell'EBV nella mucosa laterale della lingua, ma la diagnosi di OHL è scarsamente correlata alla presenza di EBV intraepiteliale. Il dato più interessante su 56 HIV+ è che il rischio di OHL è minore fra i consumatori di alcool e nei soggetti trattati con fluconazolo, mentre è maggiore nei soggetti che hanno molti CD8 e soprattutto nei fumatori (per cui la cessazione dal fumo viene a rappresentare un mezzo di prevenzione dell'OHL).

Bibliografia

  1. Griffiths P.D.: Infectious Agents Diseases, 5: 231, 1996
  2. D'Souza P.: Nature Medicine, 2: 1293, 1996
  3. Berger E.: Science, 272: 872, 1996
  4. Zhang L.: Nature, 383: 768, 1996
  5. Hoxie L.: Nature, 381: 647, 1996
  6. Fauci A.: Nature, 384: 529, 1996
  7. Balter M.: Science, 274: 1464, 1996
  8. Knight S.C.: AIDS, 10: 807, 1996 Lancet, 348: 649, 1996
  9. Cohen J.: Science, 273: 1797, 1996
  10. Landau I.: Science, 273: 302, 1996
  11. O'Brien: Science, 273: 1740,
  12. Fauci A.: Nature Medicine, 2: 966, 1996
  13. Birx D.: AIDS, 10: S3-S85, 1996
  14. Lafeuillade A.: J. AIDS Human Retrov., 12: 95, 1996
  15. Miller G.: New England J. Medicine, 334: 1292, 1996
  16. O'Leary J.J.: Nature Medicine, 2: 862, 1996
  17. Offermann M.K.: J. AIDS Human Retrov. 13: 1, 1996
  18. Boulter A.W.: AIDS, 10: 935, 1996